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分析實時PCR實驗的步驟及注意事項
發(fā)布時間： 2025-06-26 點擊次數(shù)： 499次實時PCR實驗，也稱為實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR），是一種在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中加入熒光基團(tuán)，通過實時監(jiān)測熒光信號積累來監(jiān)測每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量，進(jìn)而對待測樣品中的目的序列進(jìn)行定量分析的方法。實時PCR實驗的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料（如SYBR Green）或熒光探針（如TaqMan探針）。這些熒光物質(zhì)可以與DNA雙鏈結(jié)合，并在PCR擴(kuò)增過程中隨著DNA的增加而發(fā)出熒光信號。熒光信號的強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的量成正比，從而可以通過熒光信號強(qiáng)度來推算出目標(biāo)DNA或RNA的起始濃度。實時PCR實驗的步驟：1、樣品準(zhǔn)備：包括細(xì)胞總RNA提取、RNA濃度測定、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板等步驟。2、配樣：按照實驗需要對cDNA模板加水作適當(dāng)稀釋，渦旋混勻后離心，根據(jù)實際所檢測樣品和基因的數(shù)量計算加樣體系，加入ddH2O、qPCR mix、引物等，配成一管mix，渦旋混勻后離心。3、加模板：在每個孔各加入一定量的cDNA模板，加樣完畢后蓋上管蓋，渦旋混勻后離心，去除氣泡。4、上機(jī)反應(yīng)：設(shè)置反應(yīng)溫度、孔板信息等參數(shù)，將樣品放入儀器中開始反應(yīng)。5、數(shù)據(jù)導(dǎo)出與分析：反應(yīng)結(jié)束后得到qPCR數(shù)據(jù)，根據(jù)溶解曲線查看數(shù)據(jù)的有效性，導(dǎo)出數(shù)據(jù)為EXCEL文件并保存，進(jìn)行進(jìn)一步分析。實時PCR實驗的注意事項：1、防止污染：實驗過程中要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，防止擴(kuò)增序列的殘留污染和樣品間的交叉污染。2、準(zhǔn)確加樣：使用一次性吸頭，避免吸頭長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。3、設(shè)立對照：操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，以驗證PCR反應(yīng)的可靠性和擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性。4、重復(fù)實驗：為了驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性，通常需要進(jìn)行重復(fù)實驗。
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