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    分析實時PCR實驗的步驟及注意事項

    發(fā)布時間: 2025-06-26  點擊次數(shù): 499次
      實時PCR實驗,也稱為實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR),是一種在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中加入熒光基團(tuán),通過實時監(jiān)測熒光信號積累來監(jiān)測每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量,進(jìn)而對待測樣品中的目的序列進(jìn)行定量分析的方法。
      實時PCR實驗的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料(如SYBR Green)或熒光探針(如TaqMan探針)。這些熒光物質(zhì)可以與DNA雙鏈結(jié)合,并在PCR擴(kuò)增過程中隨著DNA的增加而發(fā)出熒光信號。熒光信號的強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的量成正比,從而可以通過熒光信號強(qiáng)度來推算出目標(biāo)DNA或RNA的起始濃度。
      實時PCR實驗的步驟:
      1、樣品準(zhǔn)備:包括細(xì)胞總RNA提取、RNA濃度測定、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板等步驟。
      2、配樣:按照實驗需要對cDNA模板加水作適當(dāng)稀釋,渦旋混勻后離心,根據(jù)實際所檢測樣品和基因的數(shù)量計算加樣體系,加入ddH2O、qPCR mix、引物等,配成一管mix,渦旋混勻后離心。
      3、加模板:在每個孔各加入一定量的cDNA模板,加樣完畢后蓋上管蓋,渦旋混勻后離心,去除氣泡。
      4、上機(jī)反應(yīng):設(shè)置反應(yīng)溫度、孔板信息等參數(shù),將樣品放入儀器中開始反應(yīng)。
      5、數(shù)據(jù)導(dǎo)出與分析:反應(yīng)結(jié)束后得到qPCR數(shù)據(jù),根據(jù)溶解曲線查看數(shù)據(jù)的有效性,導(dǎo)出數(shù)據(jù)為EXCEL文件并保存,進(jìn)行進(jìn)一步分析。
      實時PCR實驗的注意事項:
      1、防止污染:實驗過程中要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程,防止擴(kuò)增序列的殘留污染和樣品間的交叉污染。
      2、準(zhǔn)確加樣:使用一次性吸頭,避免吸頭長時間暴露于空氣中,避免氣溶膠的污染。
      3、設(shè)立對照:操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照,以驗證PCR反應(yīng)的可靠性和擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性。
      4、重復(fù)實驗:為了驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性,通常需要進(jìn)行重復(fù)實驗。
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