一、轉(zhuǎn)基因小鼠模型構(gòu)建類型

1. 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠

• 外源基因（如人類疾病相關(guān)基因）隨機插入基因組，導(dǎo)致組成型或組織特異性過表達(dá)。

2. 基因敲入（Knock-in, KI）小鼠

• 將外源基因精準(zhǔn)插入特定位點（如內(nèi)源基因啟動子控制下），或引入點突變/報告基因（如GFP）。

3. 條件性轉(zhuǎn)基因小鼠

• 利用組織特異性Cre/loxP系統(tǒng)實現(xiàn)時空特異性表達(dá)（如僅在肝臟中表達(dá)）。

二、轉(zhuǎn)基因小鼠模型構(gòu)建方法

1. 傳統(tǒng)原核顯微注射法

適用場景：隨機插入過表達(dá)轉(zhuǎn)基因
步驟：

• 載體設(shè)計：構(gòu)建包含目標(biāo)基因的質(zhì)粒（需有啟動子、外源基因、polyA信號等）。

• 線性化DNA制備：去除質(zhì)粒骨架，提高整合效率。

• 受精卵注射：將DNA注射到受精卵的原核中（C57BL/6等品系）。

• 胚胎移植：將注射后的胚胎移植到假孕母鼠子宮。

• 基因型鑒定：通過PCR或Southern blot檢測F0代小鼠的轉(zhuǎn)基因整合。

優(yōu)缺點：

• 優(yōu)點：技術(shù)成熟，適用于大片段（可達(dá)數(shù)百kb）。

• 缺點：隨機整合可能導(dǎo)致表達(dá)不穩(wěn)定或位置效應(yīng)。

2. CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因敲入

適用場景：精準(zhǔn)插入或內(nèi)源基因替換
步驟：

• 設(shè)計gRNA和供體DNA：

• gRNA靶向插入位點，供體DNA包含同源臂（~800 bp）和目標(biāo)序列。

• 遞送系統(tǒng)：

• 將CRISPR組件（Cas9 mRNA + gRNA）與供體DNA共注射到受精卵。

• 驗證：通過長片段PCR或測序確認(rèn)精準(zhǔn)整合。

優(yōu)缺點：

• 優(yōu)點：高效、精準(zhǔn)，可插入大片段（需結(jié)合同源重組）。

• 缺點：需優(yōu)化同源重組效率，可能產(chǎn)生非預(yù)期插入。

3. ES細(xì)胞打靶（同源重組）

適用場景：復(fù)雜修飾（如條件性敲入）
步驟：

• 構(gòu)建靶向載體：含同源臂、目標(biāo)基因及篩選標(biāo)記（如NeoR）。

• ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選：通過陽性/陰性選擇（如PNS）獲得正確重組的ES克隆。

• 囊胚注射：將ES細(xì)胞注入囊胚，移植后獲得嵌合體小鼠。

• 繁育傳代：嵌合體與野生型交配獲得雜合子后代。

優(yōu)缺點：

• 優(yōu)點：精準(zhǔn)可控，適合復(fù)雜設(shè)計。

• 缺點：周期長（6個月以上），成本高。

三、條件性轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)

1. Cre-loxP系統(tǒng)

• 將目標(biāo)基因兩側(cè)插入loxP位點，與組織特異性Cre小鼠交配后實現(xiàn)條件性表達(dá)或敲除。

• 常用啟動子：Alb（肝臟）、Nestin（神經(jīng)）、Vil1（腸道）。

2. Tet-On/Off系統(tǒng)

• 通過四環(huán)素或強力mei素誘導(dǎo)基因表達(dá)（如肝特異性Tet-OFF-Alb-rtTA）。

四、關(guān)鍵注意事項

1. 表達(dá)驗證

• 需通過qPCR、Western blot或免疫組化確認(rèn)外源基因表達(dá)水平和組織分布。

2. 表型分析

• 根據(jù)目標(biāo)基因功能設(shè)計表型檢測（如行為學(xué)、病理學(xué)、代謝指標(biāo)）。

3. 品系選擇

• 常用背景品系：C57BL/6（遺傳穩(wěn)定）、BALB/c（免疫研究）。

4. 遺傳穩(wěn)定性

• 需連續(xù)傳代驗證轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定遺傳（部分品系可能出現(xiàn)沉默或丟失）。

五、常見問題與解決方案

六、應(yīng)用案例

• 阿爾茨海默病模型：過表達(dá)人類APP突變基因（如APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因）。

• 癌癥模型：條件性激活致癌基因（如KrasG12D; p53loxP）。

• 報告基因模型：敲入熒光蛋白（如Rosa26-LSL-tdTomato）追蹤細(xì)胞譜系。